Object

Abstract:

Rheumatoid arthritis (RA) is an autoimmune systemic inflammatory disorder. RA is a serious medical, social and economic problem. The complex and unclear etiology makes prophylaxis, diagnostics and pharmacotherapy difficult, leading to serious health effects of patients. It is believed that RA is developed in predisposed individuals by a combination of genetics, epigenetic modifications, and environmental factors such as smoking, or viral and bacterial infections. Understanding the factors and mechanisms responsible for the onset and course of the disease is one of the main goals of research in RA. One of the bacteria associated with the development of RA is Proteus mirabilis. Like other gram-negative bacteria, P. mirabilis is characterized by the presence of an immunogenic lipopolysaccharide (LPS) covering the surface of the cell wall. However, the importance of specific anti-LPS P. mirabilis antibodies in the study of the influence of bacteria on the development of RA is controversial, as these antibodies can also be detected at a high level in healthy people. Nevertheless, the work so far has focused on testing the level of anti-LPS antibodies. There is no information about the properties of the detected antibodies which, in conditions of disturbed homeostasis of the immune system, can promote the development of the disease.
The aim of this dissertation was to characterize P. mirabilis LPS binding antibodies in terms of quantity, class, binding strength, cross-reactivity and the ability to activate complement after binding to the antigen 125 human sera belonging to patients suffering from RA and other rheumatic diseases, and from healthy blood donors were used in the study. Moreover, during the research, 24 different antigens in the form of lipopolysacchardides, type I collagen and synthetic haptens corresponding to the LPS fragments of P. mirabilis were used. The experimental part of the work was conceptually divided into several stages. The first, concerning the analysis of biological material in the form of endotoxin preparates and sera, was aimed at qualitative analysis of the used antigens and the characterization of sera in terms of the presence of autoantibodies. In this stage, the following techniques were used: infrared spectroscopy, polyacrylamide gel electrophoresis and serological methods. The obtained information allowed for a reliable analysis of the generated results in the further parts of the work. In the next stage, an attempt was made detect anti-LPS P. mirabilis antibodies in the tested sera and the class of detected immunoglobulins was determined. The last stage of the work was to assess the binding strength of anti-LPS antibodies in the sera of RA patients, the ability to cross-react and the potential for complement factor C3b deposition on purified antibodies immune complex. Using of ELISA, Western blot and Dot blot techniques, it was shown that, depending on the test performed, the level of detected antibodies binding to LPS P. mirabilis O3 was similar or higher (p <0.05) compared to patients with other rheumatic diseases and blood donors. The level of antibodies was individual and did not depend on the health status of the blood donor and the level of autoantibodies (p > 0.05). The analysis of the obtained data allowed not only to assess the level of serum reactivity with the tested LPS, but also to determine the appropriate relationships. The detected antibodies belonged mainly to the IgG class (p <0.05), but their amount was nevertheless correlated with the level of IgM antibody response (p <0.05). A positive correlation was shown between the serum reaction with the synthetic Lys-GalA-PAA hapten and other LPS containing lysine residue. In addition, the age of the blood donor and the treatment regimen also had an impact on the serum response.
Despite a tendency indicating a lower binding strength of anti-LPS P. mirabilis O3 antibodies derived from the sera of RA patients, statistical analysis did not show a difference in their avidity and affinity compared to healthy blood donors. The analysis of the affinity chromatography results showed higher level of antibodies binding to LPS P. mirabilis O3 in the group of RA patient sera. Moreover, the statistical analysis showed a correlation between the concentration of purified antibodies and the presence of disease markers (p <0.05). Studies had also shown that immune complexes of purified antibodies can bind C3b factor, and the level of deposited protein depends on the level of reaction with the antigen and its type, as well as the presence of autoantibodies. Based on the analysis of the obtained results, it can be concluded that the level of anti-LPS P. mirabilis O3 antibodies is not associated with the occurrence of RA. Antibodies detected in RA patients tend to have decreased binding strength and increased cross-reactivity compared to healthy blood donors. Purified antibodies against LPS P. mirabilis O3 show the ability to activate complement during the reaction with type I collagen, which may contribute to the aggravation of the disease.




Reumatoidalne zapalenie stawów (RA, ang. rheumatoid arthritis) jest ogólnoustrojową chorobą zapalną o charakterze autoimmunologicznym. Choroba ta, stanowi poważny problem medyczny, społeczny i gospodarczy. Złożona i niejasna etiologia wpływa na utrudnioną profilaktykę, diagnostykę i farmakoterapię prowadząc do poważnych skutków zdrowotnych pacjentów. Uważa się, że RA rozwija się u osób predysponowanych poprzez kombinacje uwarunkowań genetycznych, modyfikacji epigenetycznych oraz czynników środowiskowych, takich jak palenie tytoniu lub infekcje wirusowe i bakteryjne. Poznanie czynników i zrozumienie mechanizmów odpowiedzialnych za zapoczątkowanie i przebieg choroby są jednym z głównych celów badań dotyczących RA. Jedną z bakterii wiązanych z rozwojem RA jest Proteus mirabilis. Podobnie jak inne bakterie Gram-ujemne, P. mirabilis cechuje się obecnością immunogennego lipopolisacharydu (LPS) pokrywającego powierzchnię ściany komórkowej. Znaczenie swoistych przeciwciał anty-LPS P. mirabilis w badaniach wpływu bakterii na rozwój RA ma jednak charakter dyskusyjny, ponieważ przeciwciała te mogą być wykrywane na wysokim poziomie również u osób zdrowych. Niemniej jednak dotychczasowe prace skupiały się na badaniu poziomu przeciwciał anty-LPS. Nie ma informacji na temat właściwości wykrywanych przeciwciał, które w warunkach zaburzeń homeostazy układu immunologicznego mogą promować rozwój choroby.
Celem niniejszej dysertacji była charakterystyka przeciwciał wiążących się z LPS P. mirabilis pod kątem ilości, klasy, siły wiązania, reaktywności krzyżowej oraz zdolności do aktywacji dopełniacza po związaniu z antygenem. W pracy wykorzystano 125 surowic ludzkich należących do pacjentów cierpiących na RA i inne choroby reumatyczne oraz zdrowych dawców krwi. Podczas badań wykorzystano 24 różnych antygenów w postaci lipopolisachardydów, kolagenu typu I i syntetycznych haptenów odpowiadających fragmentom LPS P. mirabilis. Część eksperymentalna pracy została koncepcyjnie podzielona na kilka etapów. Pierwszy, dotyczący analizy materiału biologicznego w postaci preparatów endotoksyn i surowic, miał na celu analizę jakościową wykorzystanych antygenów oraz charakterystykę surowic pod kątem obecności autoprzeciwciał. W tym etapie wykorzystano techniki: spektroskopię w podczerwieni, elektroforezę w żelu poliakrylamidowym oraz metody serologiczne, a uzyskane informacje pozwoliły na szczegółową analizę wynikówwygenerowanych w dalszych częściach pracy. W kolejnym etapie podjęto próbę detekcji przeciwciał anty-LPS P. mirabilis w badanych surowicach oraz określono klasę wykrywanych immunoglobulin. Ostatni etap pracy miał na celu ocenę siły wiązania przeciwciał anty-LPS w surowicach pacjentów RA, zdolność do reaktywności krzyżowej i potencjał do aktywacji dopełniacza.
Dzięki zastosowaniu technik ELISA, Western blot i Dot blot wykazano, że w zależności od wykonywanego testu poziom wykrywanych przeciwciał wiążących się z LPS P. mirabilis O3 był podobny lub wyższy (p < 0,05) w porównaniu do pacjentów z innymi chorobami reumatycznymi i dawcami krwi. Poziom przeciwciał miał charakter indywidualny i nie był zależny od stanu zdrowia dawcy i poziomu autoprzeciwciał (p > 0,05). Analiza uzyskanych danych pozwoliła nie tylko na ocenę poziomu reaktywności surowic z badanymi LPS, ale również na ustalenie odpowiednich zależności. Wykryte przeciwciała należały głównie do klasy IgG (p < 0,05), niemniej jednak ich ilość była skorelowana z poziomem reakcji przeciwciał klasy IgM (p < 0,05). Pozytywną korelację obserwowano między reakcją surowicy z syntetycznym haptenem Lys-GalA-PAA, a innymi LPS zawierającymi w składzie lizynę. Ponadto na poziom reakcji miał również wiek dawcy krwi i sposób leczenia. Pomimo wyraźnej tendencji wskazującej na mniejszą siłę wiązania przeciwciał anty- LPS P. mirabilis O3 pochodzących z surowic pacjentów RA, analiza statystyczna nie wykazała różnicy w poziomie ich zachłanności i siły wiązania w porównaniu do zdrowych dawców krwi. Analiza ilości oczyszczonych na kolumnie chromatograficznej przeciwciał wykazała ich wyższy poziom w grupie surowic pacjentów RA. Wykazano korelację pomiędzy stężeniem oczyszczonych przeciwciał, a występowaniem markerów choroby (p < 0,05). Pomimo podobnego rozcieńczenia, próbki oczyszczonych przeciwciał anty-LPS P. mirabilis O3 pochodzące od pacjentów RA, wykazywały tendencję lub w sposób istotny statystycznie silniej reagowały krzyżowo z badanymi LPS, haptenami i kolagenem typu I. Podczas prowadzonych badań wykazano również, że kompleksy immunologiczne wytworzone przez oczyszczone przeciwciała mogą wiązać białko dopełniacza C3b, a poziom wiązania jest zależny od poziomu reakcji z antygenem i jego rodzajem, a także obecnością autoprzeciwciał. Analiza korelacji wykazała również ujemną zależność pomiędzy aktywnością wiązania kompleksu C3b, a indeksem powinowactwa. Na podstawie analizy uzyskanych wyników można wnioskować, że poziom przeciwciał anty-LPS P. mirabilis O3 nie jest związany z występowaniem RA. Przeciwciała wykryte u pacjentów RA wykazują tendencję do zmniejszonej siły wiązania i zwiększonej reaktywności krzyżowej w porównaniu do zdrowych dawców krwi. Oczyszczone przeciwciała przeciwko LPS P. mirabilis O3 wykazują zdolność do aktywacji dopełniacza podczas reakcji z kolagenem typu I, co może przyczyniać się do zaostrzenia choroby.

Additional notes:

Streszcz. ang. ; Zawiera bibliografię ; Zawiera ilustracje

Identifier:

oai:bibliotekacyfrowa.ujk.edu.pl:4719

Computer catalogue:

click here to follow the link

Language:

pol

Degree name:

doktor

Date obtained:

31.05.2022

Degree grantor:

Uniwersytet Jana Kochanowskiego w Kielcach

Supervisor:

Kaca, Wiesław (1950- ) ; Żarnowiec, Paulina Maria. Promotor pomocniczy

Field:

Dziedzina nauk ścisłych i przyrodniczych

Scientific disciplines:

Nauki biologiczne

Faculty:

Wydział Nauk Ścisłych i Przyrodniczych

Type:

rozprawa doktorska

Access rights:

tylko w Oddziale Informacji Naukowej

Publication status:

niepublikowana