Obiekt

Abstrakt:

Bortezomib to lek przeciwnowotworowy, który jest wybiórczo odwracalnym inhibitorem proteosomu 26S. Zapobiega proteolizie kompleksu ubikwityna-proteosom, co z kolei prowadzi do zahamowania wzrostu nowotworu i tworzenia się nowych naczyń włosowatych, śmierci komórek patologicznych na drodze apoptozy. Blokowanie degradacji proteasomalnej prowadzi do gromadzenia się białek wewnątrzkomórkowych, a następnie stresu komórkowego. Następstwem stresu oksydacyjnego może być zarówno zwiększenie, jak i zmniejszenie aktywności enzymów antyoksydacyjnych. W prezentowanej pracy postanowiono ocenić oddziaływanie bortezomibu na zmienione nowotworowo hepatocyty należące do linii komórkowej HepG2. Głównym celem pracy było zbadanie wpływu bortezomibu w czterech różnych stężeniach na aktywność enzymów antyoksydacyjnych, które chronią komórki przed stresem oksydacyjnym indukowanym działaniem leku. Ponadto przeprowadzony eksperyment miał na celu określenie zależności pomiędzy aktywnością/stężeniem wybranych parametrów stresu oksydacyjnego a zróżnicowanym stężeniem (dawką) i czasem inkubacji bortezomibu oraz ocenę wpływu bortezomibu na apoptozę komórek linii HepG2. W pracy przyjęto założenia (hipotezy), że: aktywność wybranych enzymów antyoksydacyjnych będzie uzależniona od stężenia oraz czasu oddziaływania bortezomibu w medium hodowlanym, stężenie glutationu i dialdehydu malonowego będzie uzależnione od stężenia oraz czasu inkubacji z lekiem w medium hodowlanym, wyższe stężenia bortezomibu oraz wydłużony czas inkubacji spowodują większą dynamikę zmian w aktywności enzymów antyoksydacyjnych oraz bortezomib zaburzy potencjał oksydoredukcyjny. Badania konieczne do zweryfikowania postawionych hipotez i osiągnięcia celu pracy zakładały ocenę aktywności dysmutazy ponadtlenkowej, katalazy, S-transferazy glutationowej, reduktazy glutationowej, peroksydazy glutationowej oraz oznaczenie stężenia glutationu i dialdehydu malonowego w komórkach hepatocytów linii HepG2 eksponowanych na zróżnicowane stężenie i czas oddziaływania bortezomibu w medium hodowlanym. Określono także w jakim stopniu bortezomib wpływa na indukcję apoptozy komórek linii HepG2 w warunkach hodowli in vitro. Badania przeprowadzono na linii komórkowej ludzkiego nowotworu wątroby HepG2 (human hepatocellular carcinoma cell line). Do medium hodowlanego dodawano bortezomib o określonym stężeniu: 2nM, 4nM, 8nM, 16nM. Grupy kontrolne stanowiły linie komórek nie poddane działaniu bortezomibu.Komórkiinkubowano odpowiednio przez 24 h i 48h. Wpływ bortezomibu w zakresie stężeń od 2 nM do 16 nM na przeżywalność hepatocytów zbadano metodą cytometrii przepływowej. Pomiary wskaźników równowagi oksydacyjno-redukcyjnej, tj. stężenia GSH, MDA, aktywności CAT, SOD, GPx, GSSRd i GST oznaczono wykorzystując opisane w literaturze metody badawcze oparte na spektrofotometrycznych technikach pomiaru absorbancji, wykorzystując również komercyjne zestawy odczynników do analiz biochemicznych.
Wyniki przeprowadzonych badań wykazały, że bortezomib jest wysoce aktywnym cytostatykiem, indukuje apoptozę komórek HepG2.Wraz ze wzrostem stężenia bortezomibu i czasu inkubacji z tym lekiem zwiększa się liczba komórek we wczesnej i późnej apoptozie. Przy wszystkich dawkach bortezomibu po 24-godzinnej inkubacji z tym lekiem obserwowano wyższe aktywności reduktazy glutationowej i istotnie statystycznie różne aktywności dysmutazy ponadtlenkowej. Przy wszystkich dawkach bortezomibu po 48 godzinach obserwowano większą liczbę komórek w stanie późnej apoptozy, niższe stężenie zredukowanego glutationu i niższą aktywność S-transferazy glutationowej. Tylko w niektórych przypadkach bortezomib zwiększał stężenie dialdehydu malonowego oraz obniżał aktywność peroksydazy glutationowej (GPx) i katalazy (CAT). Po 48-godzinnej inkubacji z bortezomibem zaobserwowano dodatnią i statystycznie istotną korelację (rho=0,999, p=0,01) pomiędzy aktywnością GPx i CAT. Nie stwierdzono istotnych korelacji pomiędzy badanymi parametrami antyoksydacyjnymi a apoptozą. Badania potwierdziły, że poziom parametrów antyoksydacyjnych w komórce jest wyznacznikiem cytotoksyczności bortezomibu. Powyższe parametry nie były analizowane w takim stopniu w linii HepG2.

Bortezomib is an anticancer drug that is a selectively reversible inhibitor of the 26S proteasome. It prevents proteolysis of the ubiquitin-proteasome complex, which in turn leads to inhibition of tumor growth and formation of new capillaries, pathological cell death-apoptosis. Blocking proteasomal degradation leads to accumulation of intracellular proteins, followed by cellular stress. The consequence of oxidative stress can be both increased and decreased activity of antioxidant enzymes. In the presented study, we decided to evaluate the effects of bortezomib on hepatocytes belonging to the HepG2 cell line. The main objective of the study was to investigate the effect of bortezomib at four different concentrations on the activity of antioxidant enzymes that protect cells from drug-induced oxidative stress. In addition, the experiment was conducted to determine the relationship between the activity/concentration of selected oxidative stress parameters and varying bortezomib concentration (dose) and incubation time, and to evaluate the effect of bortezomib on the induction of apoptosis of cells of the HepG2 line. In this study, we made the assumptions (hypotheses) that: the activity of selected antioxidant enzymes will depend on the concentration and time of exposure to bortezomib in the culture medium, the concentration of glutathione and malondialdehyde will depend on the concentration and time of incubation with the drug in the culture medium, higher concentrations of bortezomib and prolonged incubation time will cause greater dynamics of changes in the activity of antioxidant enzymes, and, that bortezomib will disrupt the oxidoreduction potential. The studies necessary to verify the hypotheses and achieve the study goal included the evaluation of the activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione S-transferase (GST), glutathione reductase (GSSRd), glutathione peroxidase (GPx), as well as the determination of glutathione (GSH) and malondialdehyde (MDA)concentrations in hepatocyte HepG2cells exposed to different doses (concentrations) and exposure times of bortezomib in culture medium. We also determined the bortezomib effect on the apoptosis induction of HepG2 cells under in vitro conditions.
The study was conducted on the human HepG2 cells (human hepatocellular carcinoma cell line). Bortezomib was added to the cell medium at concentrations of: 2nM, 4nM, 8nM, 16nM. The control group was cultured without bortezomib. Cells were incubated for 24 h and 48 h, respectively. The effect of bortezomib in the concentration range of 2 nM to 16 nM on hepatocyte survival was studied by flow cytometry. Parameters indicating oxidative stress, including levels of GSH, MDA, CAT, SOD, GPx, GSSRd and GST were measured by absorbance methods. The study results showed that bortezomib is a highly active cytostatic, inducing apoptosis induction in HepG2 cells. As both the concentration of bortezomib and the incubation time with this drug increases, the number of cells in early and late apoptosis also is higher. At all bortezomib doses after 24-hour bortezomib incubation were observed higher activities of glutathione reductase and significant different activities of superoxide dismutase. At all bortezomib doses after 48-hourswas observed higher number of cells in late apoptosis, lower reduced glutathione concentration and lower glutathione S transferase activity. Only in some cases bortezomib increased the concentration of malondialdehyde, and decreased the activities of glutathione peroxidase (GPx) and catalase (CAT). After 48-hour incubation with bortezomib a positive and statistically significant correlation (rho=0.999, p=0.01) was observed between GPx and CAT activities. We did not find significant correlations between antioxidant parameters and apoptosis. The research confirmed that the levels of antioxidant parameters in the cell are a determinants of the cytotoxicity of bortezomib. Above parameters were not analyzed to this extent in the HepG2 line.

Uwagi:

Zawiera bibliografię ; Zawiera ilustracje ; Streszcz. ang.

Identyfikator:

oai:bibliotekacyfrowa.ujk.edu.pl:10760

Katalog komputerowy:

kliknij tutaj, żeby przejść

Język:

pol

Uzyskany tytuł:

doktor

Data uzyskania stopnia:

13.12.2023

Instytucja nadająca tytuł:

Uniwersytet Jana Kochanowskiego w Kielcach

Promotor:

Świderska-Kołacz, Grażyna ; Zmorzyński, Szymon. Promotor pomocniczy

Recenzent:

Formicki, Grzegorz ; Czeczot, Hanna

Dziedzina nauki:

Dziedzina nauk ścisłych i przyrodniczych

Dyscyplina naukowa:

Nauki biologiczne

Wydział:

Wydział Nauk Ścisłych i Przyrodniczych

Typ:

rozprawa doktorska

Prawa dostępu:

tylko w Oddziale Informacji Naukowej

Stan publikacji:

niepublikowana