Obiekt

Abstrakt:

Laser interferometry is a method widely used in the physical sciences. In the present study, a Mach-Zehnder laser interferometer was adapted and optimized to perform diffusion and release analysis of antimicrobial chemicals. The release of bacteriophages LUZ19, KTN4 and KT28 from agarose hydrogel was analyzed using an adapted interferometric system. Analysis of the antimicrobial and anti- biofilm properties of bacteriophages was also carried out by spectrophotometric evaluation of inhibition of pyocyanin and pyoverdine production, change in expression of selected genes, and microscopic imaging of stained live and dead cells. Interferometric analysis of bacteriophage release showed that all analyzed bacteriophages were effectively released from the agarose hydrogel structure. Bacteriophage LUZ19 was the most effectively released, with the amount of phage released at the 8th minute of measurement being 1.36×108 pfu/ml .The analyzed bacteriophages LUZ19, KTN4 and KT 28 inhibited both the growth of Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilm and the production of important bacterial dyes in a statistically significant manner. In addition, the bacteriophages used in the study degraded the formed bacterial biofilm while inhibiting the production of pyocyanin and pyoverdin. The analysis of gene expression changes conducted showed a reduction in the expression of lasI, lasR, lasB and pslB when the biofilm was degraded by bacteriophage KT28. Bacteriophages LUZ19 and KTN4 caused an increase in the expression of rhll and toxA genes during biofilm degradation. In addition, bacteriophage LUZ19 caused a decrease in the expression of lasI, lasR, pqsA, pqsR, lasA, lasB, pslB and toxA genes. Bacteriophage KTN4 caused a decrease in the expression of lasI, lasR, lasA and lasB genes during biofilm degradation. LUZ19 caused a decrease in the expression of all analyzed genes in bacteria during biofilm growth inhibition. Bacteriophage KTN4 inhibited lasI gene expression and caused increased expression of rhlI, lasA, lasB and toxA genes. Bacteriophage KT28 decreased the expression of lasI, lasR, pqsR, lasB and pslB genes and caused increased expression of rhlI, lasA and toxA genes. The study also analyzed the antimicrobial properties of carbosilane cationic dendrimers. The diffusion of dendrimers with attached PEG800 (KDK-PEG800) and unmodified dendrimers (KDK-NH2) was evaluated by laser interferometry. Antimicrobial properties were assessed by staining live and dead cells, followed by visualization by fluorescence microscopy. Interferometric analysis showed that the KDK-NH2 dendrimer did not diffuse through the biofilm of P. aeruginosa PAO1 bacteria in contrast to the KDK-PEG800 modified dendrimer. The PEGylated dendrimer reached a value of 9.83 × 10-9 mol at the 40th minute of measurement. The obtained diffusion result coincided with microscopic observation, which showed better penetration of the modified dendrimer into the biofilm structure, as visualized by the higher number of dead bacterial cells inside the structure.
The research also included an analysis of the antimicrobial properties of thiocsugars. In the experiments I performed spectrofluorimetric analysis of the inhibition of and pyocyanin production, changes in the escpression of selected genes, and photographs of stained live and dead cells. In addition, it was analyzed the diffusion of selected thiosaccharides through the biofilm of Pseudomonas aeruginosa bacteria. The study showed that dendrimer No. 20 and 23 statistically significantly inhibited the production of key dyes compared to the antibiotic gentamicin. Other analyses did not show significantly better properties of dendrimers No. 16a, 20 and 23 than those of the antibiotic. However, the tested compounds inhibited the production of pyocyanin and pyoverdine and reduced the production of biofilm mass. Interferometric analysis of the diffusion of thiosaccharides through the biofilm showed that compound 16a diffused most effectively while compound 23 diffused least effectively. Examination of gene expression showed inhibition of the expression of most of the analyzed genes by compound 23 and of individual genes by compounds 16a and 20. In addition, the analyzed compounds significantly increased the expression of pqsA genes,and in the case of compounds 16a and 20 also the expression of lasI and pqsR genes. In the next step, I analyzed the release of lysozyme degradation products from 6-anhydro-α-L-galacto-β-D-galactan modified nanohydroxyapatite. The experiment showed the level of concentration of degradation products and the distance over which the released compounds diffuse from the nanohydroxyapatite surface. The degradation products diffused to a distance of 4.209 mm or the hydrogel surface. During the 80-minute measurement about 0.027 (a.j.) degradation products were released into the environment. In the final step, a modified laser interferometer was used to evaluate the release of fluconazole from 6-anhydro-α-L-galacto-β-D-galactan modified with nanohydroxyapatite. The test showed a release of 0.93mg of fluconazole after 54 minutes of measurement. The modified interferometer system allowed detailed evaluation of the diffusion of chemicals and bacteriophages through the biofilm of Pseudomonas aeruginosa bacteria, as well as assessment of the release of chemicals from hydrogels.



Interferometria laserowa jest metodą powszechnie stosowaną w naukach fizyczny. W niniejszej pracy przystosowano i zoptymalizowano interferometr laserowy Macha-Zehndera na potrzeby przeprowadzenia analizy dyfuzji i uwalniania substancji chemicznych o właściwościach przeciwdrobnoustrojowych. Za pomocą przystosowanego układu interferometrycznego dokonano analizy uwalniania bakteriofagów LUZ19, KTN4 i KT28 z hydrożelu agarozowego. Przeprowadzono również analizę właściwości przeciwbakteryjnych oraz przeciw biofilmowych bakteriofagów poprzez spektrofotometryczną ocenę zahamowania produkcji piocyjaniny i piowerdyny, zmianę ekspresji wybranych genów oraz mikroskopowego obrazowania wybarwionych komórek żywych i martwych. Interferometryczna analiza uwalniania bakteriofagów wykazała, że wszystkie analizowane bakteriofagi skutecznie uwalniały się ze struktury hydrożelu agarozowego. Najskuteczniej uwalniał się bakteriofag LUZ19, którego ilość uwolnionych fagów w 8 minucie pomiaru wynosiła 1,36×108 pfu/ml . Analizowane bakteriofagi LUZ19, KTN4 i KT 28 hamowały w sposób istotny statystycznie zarówno wzrost biofilmu Pseudomonas aeruginosa PAO1 jak i produkcję kluczowych dla bakterii barwników. Dodatkowo wykorzystane w pracy bakteriofagi degradowały utworzony biofilm bakteryjny hamując przy tym produkcję piocyjaniny oraz piowerdyny. Przeprowadzona analiza zmiany ekspresji genów wykazała zmniejszenie ekspresji lasI, lasR, lasB oraz pslB w przypadku degradacji biofilmu przez bakteriofaga KT28. Bakteriofagi LUZ19 i KTN4 powodowały wzrost ekspresji genów rhll oraz toxA podczas degradacji biofilmu. Dodatkowo bakteriofag LUZ19 powodował zmniejszenie ekspresji genów lasI, lasR, pqsA, pqsR, lasA, lasB, pslB oraz toxA. Bakteriofag KTN4 podczas degradacji biofilmu powodował zmniejszenie ekspresji genów lasI, lasR, lasA oraz lasB. W przypadku analizy zmiany ekspresji genów u bakterii podczas hamowania wzrostu biofilmu bakteriofag LUZ19 spowodował zmniejszenie ekspresji wszystkich analizowanych genów. Bakteriofag KTN4 hamował ekspresję genu lasI oraz powodował zwiększoną ekspresję genów rhlI, lasA, lasB i toxA. Bakteriofag KT28 zmniejszał ekspresję genów lasI, lasR, pqsR, lasB oraz pslB, a także powodował zwiększenie ekspresji genów rhlI, lasA oraz toxA. W pracy analizowano również przeciwbakteryjne właściwości karboksykrzemianowych dendrymerów kationowych. Za pomocą interferometrii laserowej oceniono dyfuzję dendrymerów z dołączoną grupą PEG800 (KDK-PEG800) oraz nie modyfikowanych dendrymerów (KDK-NH2). Właściwości przeciwbakteryjne oceniono poprzez wybarwienie komórek żywych i martwych, a następnie ich wizualizację za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Analiza interferometryczna wykazała, że dendrymer KDK-NH2 nie dyfundował przez biofilm bakterii P. aeruginosa PAO1 w odróżnieniu od dendrymeru modyfikowanego KDK-PEG800. PEGylowany dendrymer osiągnął w 40 minucie pomiaru wartość 9,83 × 10−9 mol. Otrzymany wynik dyfuzji był zbieżny z obserwacją mikroskopową, która wykazała lepsze wnikanie modyfikowanego dendrymeru do wnętrza struktury biofilmu, co uwidocznione było przez większą ilość martwych komórek bakteryjnych we wnętrzu struktury.
Badania obejmowały również analizę właściwości przeciwbakteryjne tiocukrów. W przeprowadzonych eksperymentach wykonano spektrofluorymetryczną analizę zahamowania produkcji piowerdyny i piocyjaniny, zmianę eskpresji wybranych genów oraz wykonano zdjęcia wybarwionych komórek żywych i martwych. Ponadto przeanalizowano dyfuzję wybranych tiocukrów przez biofilm bakterii Pseudomonas aeruginosa. W badaniach wykazano, że dendrymer nr 20 i 23 w istotny statystycznie sposób hamują produkcję kluczowych barwników w porównaniu do antybiotyku gentamycyny. W pozostałych analizach nie wykazano znacząco lepszych właściwości tiocukrów nr 16a, 20 i 23 niż właściwości antybiotyku. Badane związki hamowały jednak produkcję piocyjaniny oraz piowerdyny, a także ograniczały wytwarzanie masy biofilmu. Interferometryczna analiza dyfuzji tiocukrów przez biofilm wykazała, iż najskuteczniej dyfundował związek nr 16a, natomiast związek 23 dyfundował najsłabiej. Badanie ekspresji genów wykazało hamowanie ekspresji większości analizowanych genów przez wiązek nr 23 oraz poszczególnych genów przez związek nr 16a i 20. Ponadto, analizowane związki zwiększały w istotny sposób ekspresję genów pqsA, a w przypadku związków 16a i 20 również ekspresję genów lasI i pqsR. W kolejnym etapie za pomocą metody interferometrii laserowej analizowano uwalnianie do środowiska produktów degradacji 6-anhydro-α-L-galakto-β-D-galaktanu modyfikowanego nanohydroksyapatytem przez lizozym. W badaniach tych określono stężenie produktów degradacji oraz odległość na jaką dyfundowały uwolnione związki od powierzchni nanohydroksyapatytu. Produkty degradacji dyfundowały na odległość 4,209 mm or powierzchni hydrożelu. Podczas 80 minutowego pomiaru ok. 0,027 (a.j.) produktów degradacji zostało uwolnionych do środowiska. W ostatni etapie wykorzystano zmodyfikowany interferometr laserowy do oceny uwalniania flukonazolu z 6-anhydro-α-L-galakto-β-D-galaktanu modyfikowanego nanohydroksyapatytem. Badanie wykazało uwolnienie 0,93mg flukonazolu po 54 minutach pomiaru. Zmodyfikowany układ interferometru pozwolił na szczegółową ocenę dyfuzji związków chemicznych oraz bakteriofagów przez biofilm bakterii Pseudomonas aeruginosa, a także ocenę uwalniania związków chemicznych z hydrożeli.

Uwagi:

Zawiera bibliografię ; Zawiera ilustracje

Identyfikator:

oai:bibliotekacyfrowa.ujk.edu.pl:9215

Katalog komputerowy:

kliknij tutaj, żeby przejść

Język:

pol

Uzyskany tytuł:

doktor

Data uzyskania stopnia:

31.05.2023

Instytucja nadająca tytuł:

Uniwersytet Jana Kochanowskiego w Kielcach

Promotor:

Arabski, Michał (1978- ) ; Wąsik, Sławomir (fizyka). Promotor pomocniczy

Dziedzina nauki:

Dziedzina nauk ścisłych i przyrodniczych

Dyscyplina naukowa:

Nauki biologiczne

Wydział:

Wydział Nauk Ścisłych i Przyrodniczych

Typ:

rozprawa doktorska

Prawa dostępu:

tylko w Oddziale Informacji Naukowej

Stan publikacji:

niepublikowana