Obiekt

Abstrakt:

porność bakterii na antybiotyki stanowi obecnie jedno z najpoważniejszych wyzwań współczesnej medycyny, prowadząc do wzrostu zachorowalności i śmiertelności na całym świecie. Szczególnym problemem są bakterie Gram-ujemne, których błona zewnętrzna stanowi skuteczną barierę utrudniającą przenikanie antybiotyków. Wobec ograniczonej skuteczności klasycznych terapii coraz większe znaczenie zyskują alternatywne strategie terapeutyczne oparte na białkach i nanomateriałach przeciwdrobnoustrojowych. w tym na dendrymerach. Białka takie jak endolizyny fagowe rozkładają peptydoglikan ściany komórkowej bakterii, natomiast dendrymery mogą zwiększać przepuszczalność błony zewnętrznej, wspomagając działanie endolizyn wobec bakterii Gram-ujemnych. Celem pracy było określenie wpływu kationowych dendrymerów karbokrzemowych zawierających pierścienie imidazolowe (Dend), jony srebra (DendAg), a także pierścienie pirydylowe z jonami srebra (DendCh, DendAgCh) na wrażliwość bakterii Pseudomonas aeruginosa PAO1 oraz ocena ich zdolności do wzmacniania działania domeny CHAP endolizyny z bakteriofaga d>812. Szczep P. aeruginosa został wybrany ze względu na wysoki poziom oporności wynikający z mutacji, modyfikacji enzymatycznych oraz zdolności do tworzenia biofilmów. W niniejszej pracy wykazano, że kationowe dendrymery ograniczają wzrost bakterii oraz indukują permeabilizację błony zewnętrznej, co ułatwia przenikanie endolizy ny do warstwy peptydoglikanu i jego degradację. Stopień permeabilizacji zależał jednak od rodzaju zastosowanego dendrymeru. Dodatkowo, aktywność enzymatyczna endolizyny względem peptydoglikanu wzrastała w obecności dendrymerów. Analiza termodynamiczna interakcji między dendrymerami a endolizyną wykazała, że związki te łączą się poprzez wiązania elektrostatyczne w procesie egzotermicznym (DendAg, DendCh, DendAgCh) w niskich temperaturach oraz endotermicznym (Dend) w' wyższych temperaturach. Oceniono również synergistyczne działanie dendrymerów i endolizyny wobec bakterii - trzy spośród czterech badanych dendrymerów wykazały efekt synergii, co uzasadniło wyłączenie Dend z dalszych badań. Morfologię i wielkość dendrymerów oraz ich kompleksów z endolizyną określono za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) i dynamicznego rozpraszania światła (DLS). Ze względu na hydrofobowy charakter cząsteczek zaobserwowano ich tendencję do tworzenia agregatów o wielkości 350-800 nm. W dalszym etapie badań analizowano produkcję reaktywnych form tlenu (ang. ROS/ poi. RFT). Dendrymery zawierające jony srebra zwiększały ilość RFT. Za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oceniono żywotność bakterii w obecności dendrymerów i endolizyny -
we wszystkich przypadkach stwierdzono spadek liczby komórek żywych i wzrost liczby martwych. Obserwacje wykonane metodami fluorescencyjną, SEM i TEM potwierdziły obecność licznych uszkodzeń błony komórkowej w postaci porów oraz degradację ściany komórkowej, co świadczy o działaniu litycznym badanych układów. Oceniono również wpływ dendrymerów i ich kompleksów z endolizyną na złożoną strukturę biofilmu bakteryjnego. W pierwszym etapie badano zdolność dendrymerów do hamowania tworzenia biofilmu w rosnących stężeniach, a następnie - w obecności endolizyny. Wykazano, że sama endolizyną wzmacnia działanie antybiofilmowe dendrymerów, natomiast stosowanie dendrymerów pojedynczo nie dawało tego efektu. Analiza mikroskopowa wykazała zmniejszenie liczby żywych komórek i wzrost liczby martwych bakterii w biofilmie, co wskazuje na uszkodzenie struktury biofilmu i działanie bójcze kompleksów dendrymer-endolizyna. Kolejnym etapem była ocena wpływu dendrymerów i endolizyny wobec biofilmu uformowanego na skórze wieprzowej, stanowiący model zakażenia skórnego. Badania z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej i SEM wykazały, że najskuteczniejsze działanie przeciwbiofilmowe wykazywały dendrymery DendAg i DendAgCh, a w mniejszym stopniu DendCh. Obserwowano zwiększenie liczby martwych komórek, liczne uszkodzenia ściany bakteryjnej oraz zmiany w strukturze matrycy biofilmu. Przeprowadzono również analizę histomorfologiczną skóry niezainfekowanej oraz zainfekowanej P. aeruginosa po zastosowaniu dendrymerów i endolizyny. W przypadku skóry niezainfekowanej wykazano, że dendrymery w różnym stopniu wpływały na struktury naskórka, prowadząc do atrofii. hipertrofii lub hiperplazji oraz miejscowego przerwania ciągłości między warstwami. W skórze zakażonej naskórek był całkowicie zdegradowany przez bakterie, z częściową degradacją skóry właściwej, co uniemożliwiało ocenę potencjalnego efektu terapeutycznego. Ostatnim etapem badań była ocena cytotoksyczności dendrymerów oraz wpływu endolizyny na łagodzenie tego efektu w hodowli fibroblastów VH10. Wykazano, że cytotoksyczność wzrastała wraz ze stężeniem dendrymerów, natomiast obecność endolizyny nieznacznie redukowała ten efekt. Podsumowując, kationowe dendrymery karbokrzemowe, w zależności od rodzaju modyfikacji, wzmacniają aktywność endolizyny oraz wykazują działanie przeciwbakteryjne wobec Pseudomonas aeruginosa PAO1 poprzez mechanizmy obejmujące permeabilizację błony komórkowej, degradację peptydoglikanu i generację reaktywnych form tlenu. Związki te wpływają również na redukcję biofilmu w warunkach in vitro i ex vivo. Wykazują jednak pewną cytotoksyczność, której nasilenie zależy od stężenia i rodzaju modyfikacji powierzchniowej dendrymeru.

Uwagi:

Zawiera bibliografię ; Zawiera ilustracje

Identyfikator:

oai:bibliotekacyfrowa.ujk.edu.pl:14105

Katalog komputerowy:

kliknij tutaj, żeby przejść

Język:

pol

Uzyskany tytuł:

doktor

Data uzyskania stopnia:

17.06.2026

Instytucja nadająca tytuł:

Uniwersytet Jana Kochanowskiego w Kielcach

Promotor:

Ciepluch, Karol ; Łysek-Gładysińska, Małgorzata

Recenzent:

Kędziora, Anna ; Ionov, Maksim

Dziedzina nauki:

Dziedzina nauk ścisłych i przyrodniczych

Dyscyplina naukowa:

Nauki biologiczne

Wydział:

Wydział Nauk Ścisłych i Przyrodniczych

Typ:

rozprawa doktorska

Prawa dostępu:

tylko w Oddziale Informacji Naukowej

Stan publikacji:

niepublikowana