Obiekt

Tytuł odmienny:

Biophysical analysis of the permeabilization mechanism of outer bacterial membrane with the participation of dendritic nanoparticles

Abstrakt:

Antybiotykooporność jest stale rosnącym zagrożeniem dla zdrowia publicznego w związku z nadużywaniem i niewłaściwym stosowaniem antybiotyków, między innymi w ambulatoriach, szpitalach, weterynarii, rolnictwie i wielu innych dziedzinach życia. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) szacuje, że oporność mikroorganizmów na antybiotyki przyczynia się rocznie do 1,27 mln zgonów na świecie, w tym 4,95 mln zgonów, jako przyczyna pośrednia. W roku 2019 w Polsce odnotowano 5 600 zgonów bezpośrednio związanych z opornością na antybiotyki i 24 100 zgonów pośrednio związanych z tym zjawiskiem w tym samym roku. Liczba zgonów z powodu antybiotykooporności na świecie do roku 2050 może wzrosnąć nawet do 10 milionów rocznie. W latach 2000–2020 globalne stosowanie antybiotyków wzrosło o 65% i w dalszym ciągu rośnie. Najnowszy raport WHO wspomina jedynie o 27 nowych antybiotykach, które aktualnie są na etapie badań klinicznych. Z tej liczby zaledwie kilka wydaje się być na tyle innowacyjne, aby móc poradzić sobie z najbardziej opornymi bakteriami. Dla porównania – w tym samym czasie w tej fazie badań znajduje się ponad tysiąc leków onkologicznych.
W latach 2017-2021 zarejestrowano tylko jeden nowy antybiotyk, zdolny do pokonania superbakterii z listy WHO. Specjaliści w tej dziedzinie wyodrębnili najniebezpieczniejsze bakterie określone mianem bakterii z grupy ESKAPE. Nazwą jest akronim określający grupę lekoopornych bakterii, do której zalicza się: Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa i Enterobacter spp. Są to patogeny zdolne do ucieczki przed działaniem dostępnych antybiotyków, reprezentujące nowy paradygmat w zakresie patogenezy, transmisji i oporności.
Rozważając problem antybiotykoodporności w celu projektowania nowych skutecznych metod do walki z tym problemem należy przede wszystkim skupić się na zewnętrznej błonie bakteryjnej (OM) bakterii Gram ujemnych. Błona ta stanowi poważną komplikację, gdyż jest niezwykle problematyczną barierą uniemożliwiającą wnikanie do wnętrza bakterii większości dostępnych antybiotyków. Z tego względu niezwykle atrakcyjnymi substancjami są wszelkiego typu nanomateriały oraz peptydy przeciwbakteryjne. Dlatego też nowo projektowane środki powinny skupiać się przede wszystkim na zewnętrznej błonie bakteryjnej (OM), czyli środkach permeabilizujących błonę oraz zmieniających jej płynność. Kolejnym niezmiernie ważnym aspektem podczas projektowania nowych środków przeciwdrobnoustrojowych jest skład lipidowy poszczególnych błon bakteryjnych różnych grup bakterii. Skład błon wpływa na ładunek powierzchniowy (błonowy) a więc może przyczyniać się do różnić w mechanizmie działania zastosowanych materiałów.
Celem badań niniejszej pracy doktorskiej była biofizyczna analiza mechanizmu permeabilizacji zewnętrznej błony bakteryjnej przy udziale dendrytycznych nanocząstek z uwzględnieniem składu lipidowego zewnętrznej błony wykorzystanych modeli bakteryjnych. Znajomość mechanizmu towarzyszącemu permeabilizacji błony bakteryjnej może w przyszłości przyczynić się do rozwoju nowych alternatywnych metod skutecznych w walce z opornymi szczepami.
Na wstępie, analizie poddano dwa rodzaje dendronizowanych karbosilanowych nanocząstek srebra: dendronizowane nanocząstki srebra (Dend-AgNPs) oraz pegylowane dendronizowane nanocząstki srebra (PEG-Dend-AgNPs), jako samych układów oraz w obecności lizozymu. W pierwszej kolejności sprawdzono aktywność antybakteryjną obu nanocząstek oraz ich układów z lizozymem. Aktywność dendronizowanych nanocząstek srebra oraz lizozymu mierzono na wykładniczo rosnącej kulturze P. aeruginosa. Uzyskane wyniki ukazują podobny efekt przeciwbakteryjny w przypadku zastosowania obu rodzajów nanocząstek. W sytuacji uwzględnienia lizozymu w układzie efekt przeciwbakteryjny staje się zdecydowanie lepszy (Skrzyniarz i inni, International Journal of Biological Macromolecules 2023).
W celu zbadania mechanizmu działania nanocząstek przeprowadzono eksperyment badający proces permeabilizacji zewnętrznej błony bakteryjnej (OM). Uzyskane dane prezentują dwa odmienne mechanizmy działania. W przypadku Dend-AgNPs efekt permeabilizacji jest zdecydowanie silniejszy, nanocząstki te uszkadzają OM umożliwiając wnikanie lizozymu do wewnątrz bakterii. PEG-Dend-AgNPs natomiast agregują na powierzchni bakterii, efekt permeabilizacji jest słabszy, nanocząstki powodują agregację bakterii hamując ich rozwój. Dodatkowo efekt bójczy jest wspomagany generowaniem reaktywnych form tlenu (Skrzyniarz in inni, International Journal of Biological Macromolecules 2023). Następnie sprawdzono rodzaj oddziaływań testowanych dendrytycznych nanocząstek z błoną bakteryjną na modelu liposomalnym (liposomalny model zewnętrznej błony bakteryjnej szczepu bakteryjnego P. aeruginosa).W przypadku Dend-AgNPs wyniki wykazały statyczny rodzaj interakcji między błoną a nanocząstką, tworzącą stabilny kompleks. Wykazano egzotermiczny rodzaj reakcji oraz spontaniczność przy niskich temperaturach. Zupełnie odmienne wyniki otrzymano w przypadku PEG-Dend-AgNPs. Interakcja między nanocząstką a błoną jest dynamiczna, tworząc mniej stabilny kompleks. Wykazano rodzaj reakcji endotermicznej oraz spontanicznej tylko w wysokich temperaturach. Morfologia bakterii oraz degradacja peptydoglikanu bakteryjnego szczepów traktowanych nanocząstkami sprawdzono za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) oraz mikroskopii fluorescencyjnej z wykorzystaniem znacznika fluorescecyjnego HADA (FDAA 7- hydroksykumarynokarbonyloamino-D-alanina). Zdjęcia wykonane za pomocą mikroskopu TEM ukazały akumulujące się na powierzchni bakterii czarne punkty, czyli dendrytyczne nanocząstki srebra. W przypadku Dend-AgNPs widać przerwanie błony komórkowej bakterii i wypływ substancji wewnętrznych. Jeśli chodzi o PEG-Dend-AgNPs można zobaczyć agregujące komórki bakteryjne. Na zdjęciach z mikroskopii fluorescencyjnej można zauważyć, iż Dend-AgNPs uszkadzają bakteryjny peptydoglikan, a przy użyciu lizozymu efekt jest jeszcze silniejszy i następuje częściowa degradacja peptydoglikanu. Natomiast na zdjęciach z PEGDend- AgNPs ten efekt jest znacznie słabszy. Drugą pracą wchodzącą w skład rozprawy doktorskiej były badania nad permabilizacją błony bakteryjnej przez dwa rodzaje kationowych karbosilanowych dendrymerów imidazolowych: D1 (BDTRP 001) C98H200N16Si138+ oraz D2 (BDSTM 001) C160H268C18N24Si13. Badano również wpływ składu lipidowego błon bakteryjnych na poziom destabilizacji błony. W tym celu wykonano modele liposomalne trzech rodzajów bakterii: P.aeruginosa, E.coli oraz A.baumanii (Skrzyniarz i inni, Journal of Colloid and Interface Science, 2024). Na wstępie przeprowadzono badania właściwości fizykochemicznych przygotowanych liposomów oraz dendrymerów, w celu zbadania ich wielkości oraz potencjału elektrokinetycznego. Wykonano eksperymenty dynamicznego rozpraszania światła (DLS) oraz potencjału Zeta. Chcąc zbadać właściwości różnych modeli liposomalnych (a więc zbadać różnice w mechanizmie reakcji zależne od składu liposomalnego) w zależności do użytego dendrymeru, wykonano eksperyment badając zmiany w płynności błony. W tym celuwykorzystano dwa znaczniki błonowe: TMA-DPH (wbudowujący się w warstwę hydrofilową) oraz DPH (wbudowujący się w warstwę hydrofilową). Doświadczenie wykonano w celu sprawdzenia, na którą warstwę zewnętrznej bony i w jaki sposób użyte w doświadczeniu dendrymery oddziałują. Uzyskane wyniki są różne w przypadku obu zastosowanych dendrymerów. Tylko w przypadku D1 zaobserwowano zmiany w płynności zewnętrznej warstwy lipidowej.
Następnym krokiem było przeprowadzenie badań wygaszania fluorescencji, z wykorzystaniem znacznika Cyjaniny 5 (Cy5), którym został wyznakowany jeden z lipidów wykorzystanych do budowy liposomów (DOPE). Analiza termodynamiczna wykazała, iż wysokie stężenie lipidów tj. CL (kardiolipina) oraz DOPE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-PE) w zawartości błony danej bakterii gwarantuje większe powinowactwo dendrymerów antybakteryjnych i powoduje większą permeabilizację błony bakteryjnej oraz zwiększenie jej przepuszczalności. W celu zbadania efektów działania dendrymerów na każdy z modeli liposomalnych, wykorzystano mikroskopię TEM. Uzyskane zdjęcia prezentujące modele traktowane dendrymerem D1 ukazują uszkodzone bądź rozpadające się liposomy oraz ich fragmenty, natomiast w przypadku D2 można zaobserwować kuliste nieuszkodzone kształty liposomów. Ostatnim etapem pracy były testy in vitro Celem tego eksperymentu było sprawdzenie, czy destabilizacja błony może spowodować przedostawanie się endolizyny przez zewnętrzną błonę bakteryjną, degradację peptydoglikanu i w konsekwencji zwiększenie efektu bójczego, Do tej analizy wykorzystano wykładniczo rosnącą hodowlę bakterii P.aeruginosa oraz endolizynę. W odniesieniu do dendrymeru pierwszego (D1) występuje efekt antybakteryjny. Zewnętrzna błona zostaje uszkodzona. Dodatek endolizyny nie zwiększa efektu bójczego. Dendrymer drugi (D2) sam w sobie nie niszczy zewnętrznej błony bakteryjnej, ale znacząco wpływa na jej płynność. Umożliwia w ten sposób endolizynie wniknięcie do wnętrza bakterii. Podsumowując, celem przedstawionych prac była biofizyczna analiza mechanizmu permeabilizacji zewnętrznej błony bakteryjnej przy udziale dendrytycznych nanocząstek. Badania potwierdziły znaczącą rolę dendronizowanych nanocząstek oraz białek antybakteryjnych, jako przyszłościowych środków w walce z antybiotykoopornymi szczepami bakteryjnymi. Za tymi substancjami przemawia wiele pozytywnych cech takich jak ogromna możliwość modyfikowania powierzchni dendrymerów, możliwość permeabilizowania oraz wpływ na płynność błon biologicznych jak i wiele innych. Jednak projektując nowe środki należy uwzględnić bardzo ważny aspekt, jakim jest skład lipidowy zewnętrznej błony bakteryjnej poszczególnych szczepów bakteryjnych. W powyższej rozprawie udowodniono, że skład błon ma wpływ na rodzaj interakcji różnych dendrytycznych nanocząstek z zewnętrzną błoną bakteryjną. Poznanie mechanizmu towarzyszącemu integracji między błoną bakteryjną a nanomateriałami jest kluczowe w kwestii opracowywania nowych środków terapeutycznych, które w przyszłości mogą okazać się kluczowe w walce ze stale rosnącym problemem lekooporności.

Uwagi:

Streszcz. ang.  ; Zawiera ilustracje Zawiera bibliografię

Identyfikator:

oai:bibliotekacyfrowa.ujk.edu.pl:13350

Katalog komputerowy:

kliknij tutaj, żeby przejść

Język:

pol

Uzyskany tytuł:

doktor

Data uzyskania stopnia:

4.06.2025

Instytucja nadająca tytuł:

Uniwersytet Jana Kochanowskiego w Kielcach

Promotor:

Ciepluch, Karol

Recenzent:

Bukowska, Bożena  ; Jańczewski, Dominik Gruszecki, Wiesław I.

Dziedzina nauki:

Dziedzina nauk ścisłych i przyrodniczych

Dyscyplina naukowa:

Nauki biologiczne

Wydział:

Wydział Nauk Ścisłych i Przyrodniczych

Typ:

rozprawa doktorska

Prawa dostępu:

tylko w Oddziale Informacji Naukowej

Stan publikacji:

niepublikowana