Object

Abstract:

Nanocząstki srebra (AgNPs) wykazują silne działanie cytotoksyczne. Jednak, ze względu na brak swoistości działania, wykorzystanie AgNPs w terapii przeciwnowotworowej jest ograniczone. Enkapsulacja liposomalna nanocząstek metalicznych zyskuje na znaczeniu i jest metodą pozwalającą na ograniczenie kontaktu nanocząstek z otoczeniem. Ułatwia ona znacząco modyfikację powierzchni nanocząstek metalicznych oraz zwiększa ich toksyczność. Nadeskpresja receptor nabłonkowego czynnika wzrostu (EGFR) występuje w wielu typach nowotworów m.in. niedrobnokomórkowym raku płuc, czy nowotworach głowy i szyi. Receptor ten jest internalizowany przez komórkę na drodze klatryno-zależnej z zaangażowaniem lizosomu. Jednym z lepiej poznanych ligandów ww. receptora jest nabłonkowy czynnik wzrostu (EGF), o wysokim powinowactwie i zdolnością do indukcji degradacji receptora EGFR. Jednak, brak jest danych literaturowych dotyczących próby ukierunkowania działania toksycznego AgNPs do komórek nowotworowych z wykorzystaniem receptora EGFR. Dlatego celem niniejszej rozprawy doktorskiej była ocena wykorzystania enkapsulacji liposomalnej oraz czynnika EGF w ukierunkowaniu toksyczności AgNPs do komórek nowotworowych z nadekspresją receptora EGFR z jednoczesnym zmniejszeniem efektu toksycznego tych nanostruktur w komórkach zdrowych w warunkach in vitro.
W pierwszym etapie badań wykorzystano trzy ludzkie linie komórkowe tj. fibroblasty (BJ), komórki raka niedrobnokomórkowego płuc (A549) oraz komórki nowotworu płaskonabłonkowego języka (SCC-15), reprezentujące odpowiednio komórki o prawidłowej ekspresji EGFR, 3-krotnej oraz 15-krotnej nadekspresji tego receptora. W kolejnych etapach badań wykorzystano komórki ze zmniejszoną ekspresją genu EGFR za pomocą cząsteczki siRNA, uzyskując komórki EGFR-negatywne (A549EGFR- i SCC-15EGFR-) oraz komórki EGFR-pozytywne (A549EGFR+ oraz SCC-15EGFR+) – za pomocą cząsteczki siRNA o losowej sekwencji. Opracowany sposób syntezy AgNPs zamkniętych w liposomach i znakowanych EGF (EGF-LipoAgNPs) pozwolił na uzyskanie nanostruktur o średnicy 107,9 nm oraz 116,8 nm, odpowiednio dla EGF-LipoAgNPs oraz liposomów nie zawierających AgNPs (EGF-LipoE). Obserwacja mikroskopowa wytworzonych kompleksów nie ujawniła natywnych nanocząstek w roztworze, co zostało potwierdzone skanem w zakresie światła ultrafioletowego i widzialnego. Wartość ζ-potencjału wytworzonych roztworów mieściła się w przedziale -30 mV - +30 mV dla wszystkich roztworów. Wyniki badań w modelach komórkowych in vitro wykazały, że EGF-LipoAgNPs wykazywały toksyczność po 24 i 48 godzinach. Efekt ten był istotnie wyższy w komórkach A549 i SCC-15 w porównaniu do komórek BJ. Analogiczne wyniki uzyskano dla pomiaru poziomu wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS). Dodatkowo, wytworzone liposomy charakteryzowały się wyższym efektem toksycznym w stosunku do natywnych (niemodyfikowanych) AgNPs w komórkach nowotworowych. EGF-LipoAgNPs indukowały wzrost aktywności kaspazy-9 oraz kaspazy-3 po 24 i 48 godz. od podania. Zmiany na poziomie białka m.in. aktywność katalazy, dysmutazy ponadtlenkowej oraz białka KI67 potwierdziły właściwości toksyczne i antyproliferacyjne wytworzonych liposomów, których podstawą była indukcja stresu oksydacyjnego. Wyniki potwierdzono także za pomocą analiza ekspresji genów (CAT, SOD, KI67, TP53). EGF-LipoE nie wykazywały istotnego efektu dla badanych parametrów w komórkach BJ, A549 oraz SCC-15. Uzyskane wyniki badań udowodniły istotnie mniejsze pobieranie EGF-LipoAgNPs w komórkach A549EGFR- i SCC-15EGFR- w porównaniu do komórek A549EGFR+ oraz SCC-15EGFR+. Analiza poziomu mRNA udowodniła zdolność wytworzonych liposomów do indukcji wzrostu ekspresji genów związanych z przebiegiem procesu endocytozy klatryno-zależnej w komórkach EGFR- pozytywnych. Efektu takiego nie zaobserwowano w komórkach EGFR-negatywnych lub był on istotnie niższy. Podobną zależność zaobserwowano w przypadku analizy poziomu mRNA dla genów związanych z uszkodzeniem DNA oraz stresem oksydacyjnym (ATM, NRFL2). Podsumowując, opracowany sposób dostarczania AgNPs do komórek nowotworowych z nadeskpresją receptora EGFR jest skuteczny w warunkach in vitro i pozwala na zwiększenie efektu toksycznego badanych AgNPs w komórkach nowotworowych, przy jednoczesnym zmniejszeniu efektu negatywnego w komórkach zdrowych. Wywoływany efekt toksyczny był związany z indukcją stresu oksydacyjnego w komórkach nowotworowych oraz indukcją apoptozy z zaangażowaniem drogi mitochondrialnej tego procesu. Dodatkowo, uzyskane wyniki badań udowadniają pobieranie wytworzonych liposomów na drodze klatryno-zależnej z zaangażowaniem receptora EGFR.

Silver nanoparticles (AgNPs) are characterized by strong cytotoxic properties. However, due to the lack of specificity of action, the use of AgNPs in anticancer therapy is limited. Liposomal encapsulation of metallic nanoparticles is gaining in an importance and is a method that allows to limit the contact of nanoparticles with the environment. It significantly facilitates the modification of the surface of metallic nanoparticles and increases their toxicity. Epidermal growth factor receptor (EGFR) is overexpressed in many types of cancers, including non-small cell lung cancers as well as head and neck cancers. This receptor is internalized by the cell via a clathrin-dependent pathway with involvement of the lysosomes. One of the well- known ligands of the above-mentioned receptor is epidermal growth factor (EGF), with high affinity and ability to induce degradation of the EGFR receptor. However, there is no literature data on an approach to direct the toxic effect of AgNPs to cancer cells using the EGFR. Therefore, the aim of this doctoral dissertation is to evaluate the use of liposomal encapsulation and EGF in targeting of the toxicity of AgNPs to cancer cells overexpressing the EGFR, while reducing the toxic effect of these nanostructures in healthy cells in vitro. In the first stage of the research, three human cell lines were used, i.e. fibroblasts (BJ), non-small cell lung cancer cells (A549) and squamous tongue cell carcinoma cells of the (SCC- 15), representing cells with the normal expression of the EGFR receptor as well as 3- fold and 15-fold overexpression of this receptor, respectively. In the next stages of the research, cells with silenced expression of the EGFR gene were used obtained by using of the siRNA, resulting in the EGFR-negative cells (A549EGFR- and SCC-15EGFR-) and EGFR-positive cells (A549EGFR+ and SCC-15EGFR+) - using a siRNA molecule with a random sequence.
The developed method of synthesis of AgNPs encapsulated in liposomes and labeled with EGF (EGF-LipoAgNPs) allowed to obtain nanostructures with a diameter of 107.9 nm and 116.8 nm, respectively for EGF-LipoAgNPs and liposomes without AgNPs (EGF-LipoE). Microscopic observation of the formed complexes did not reveal free nanoparticles in the solution, which was confirmed by a scan in the ultraviolet and visible light range. The value of the ζ-potential of the prepared solutions was in the range between -30 mV - +30 mV. The results of the cell model-based in vitro studies have revealed that EGF-LipoAgNPs showed toxicity after 24 and 48 hours. This effect was significantly higher in A549 and SCC-15 cells, compared to BJ cells. Similar results were obtained in the level of intracellular reactive oxygen species (ROS). In addition, the synthetized liposomes were characterized by a higher toxic effect compared to native (unmodified) AgNPs in cancer cells. EGF-LipoAgNPs induced an increase in the activity of caspase-9 and caspase-3 after 24 and 48 hours of treatment. The changes at the protein level, e.g. the activity of catalase, superoxide dismutase and KI67 protein confirmed the toxic and antiproliferative properties of the produced liposomes, which were based on the induction of oxidative stress. The results were also confirmed by gene expression analysis (CAT, SOD, KI67, SHH, TP53). EGF-LipoE showed no significant effect on the tested parameters in BJ, A549 and SCC-15 cells. The obtained results showed significantly lower uptake of EGF-LipoAgNPs in A549EGFR- and SCC-15EGFR- cells compared to A549EGFR+ and SCC-15EGFR+ cells. Analysis of the mRNA level has proved the ability of the synthetized liposomes to induce an increase in the expression of genes related to the course of the process of clathrin-dependent endocytosis in EGFR-positive cells. Such an effect was not observed in EGFR-negative cells or was significantly lower. A similar relationship was observed in the analysis of mRNA levels for genes related to DNA damage and oxidative stress (ATM, NRFL2). Summarizing, the developed method of delivering AgNPs to cancer cells, overexpressing the EGFR receptor is effective in vitro and allows to increase the toxic effect of the tested AgNPs in cancer cells, while reducing the negative effect in healthy cells. The toxic effect was associated with the induction of oxidative stress in cancer cells and the induction of apoptosis with the involvement of the mitochondrial pathway of this process. In addition, the obtained results of the research prove the uptake of the produced liposomes in the clathrin- dependent way with the involvement of the EGFR receptor.

Additional notes:

Tekst częściowo w języku angielskim ; Streszcz. ang. i pol. ; Rozprawa doktorska stanowiąca cykl publikacji ; Zawiera bibliografię ; Zawiera ilustracje

Identifier:

oai:bibliotekacyfrowa.ujk.edu.pl:11995

Computer catalogue:

click here to follow the link

Language:

pol ; angielski

Degree name:

doktor

Date obtained:

3.07.2023

Degree grantor:

Uniwersytet Jana Kochanowskiego w Kielcach

Supervisor:

Szychowski, Konrad A. (prof. WSIiZ)

Reviewer:

Grenda, Anna ; Kajta, Małgorzata ; Piastowska-Ciesielska, Agnieszka

Field:

Dziedzina nauk medycznych i nauk o zdrowiu

Scientific disciplines:

Nauki medyczne

Faculty:

Collegium Medicum

Type:

rozprawa doktorska

Access rights:

tylko w Oddziale Informacji Naukowej

Publication status:

niepublikowana