@misc{Kuc-Ciepuch_Dorota_Metody,
 author={Kuc-Ciepuch, Dorota},
 howpublished={online},
 school={Uniwersytet Jana Kochanowskiego w Kielcach},
 language={pol},
 abstract={Wzrost antybiotykooporności prowadzi do poszukiwania alternatywnych strategii eliminacji bakterii Gram-ujemnych. Istotnym problemem w dostarczaniu leków o potencjale klinicznym jest pokonywanie przez nie zewnętrznej błony bakteryjnej. Celem badań było poszukiwanie nowych alternatywnych metod permeabilizacji zewnętrznej błony komórkowej bakterii Gram-ujemnych, które mogłyby dodatkowo wspomóc działanie bakteriobójcze rekombinowanej endolizyny fagowej K27. Przepuszczalność błony zewnętrznej indukowano za pomocą kationowych dendrymerów modyfikowanych maltozą, dendrytycznych nanocząstek złota oraz za pomocą aktywacji naturalnego procesu pyroptozy. Pyroptoza jest odpowiedzią immunologiczną komórek eukariotycznych na składniki komórki bakteryjnej, głównie lipopolisacharyd, prowadzącą do wydzielania białka gazderminy D, co może spowodować permeabilizację błony komórkowej bakterii. Wykazano, że związki polikationowe destabilizują zewnętrzną błonę bakteryjną P. aeruginosa, wspomagając transport endolizyny do peptydoglikanu. Zobserwowano, że nie tylko lipopolisacharyd bakteryjny jest główną przeszkodą dla silnie naładowanych kationowych dendrymerów w destabilizacji błony i dotarciu endolizyny, ale także modyfikacje powierzchniowe dendrymerów. Zmniejszenie ładunku dodatniego i stężenia w dendrymerach polipropylenowo-iminowych maltozy istotnie zwiększyło przeciwbakteryjne działanie endolizyny. Jednocześnie modyfikacja powierzchni dendrymerów prowadzi do zahamowania aktywności endolizyny w niższej temperaturze (<30oC) w porównaniu z dendrymerami niezmodyfikowanymi. W dalszych badaniach zastosowono nanocząstki złota w celu sprawdzenia, czy mogą one indukować proces pyroptozy. W tym celu wykorzystano linię komórkową THP-1. Dendrytyczne AuNP indukowały aktywność kaspazy-1 i zwiększały uwalnianie interleukiny IL-18 i IL-1β bez indukowania rozszczepienia gazderminy D i tworzenia porów. Produkcja cytokin prozapalnych była widoczna głównie w obecności bakteryjnego LPS-u, chociaż ich wydzielanie obserwowano dopiero po podaniu dendrytycznych AuNP. Obserwacje te sugerują, że dendrytyczne AuNP mogą indukować mechanizmy zapalne podobne do pyoptozy, dodatkowo wzmacniane w obecności bakteryjnego LPS-u. Intensywność tego efektu zależała od modyfikacji powierzchni AuNP. Wyniki te wyraźnie sugerują, że charakter interakcji między NP i LPS-ami zależy od generacji dendronów i liczby łańcuchów PEG przyłączonych do ich powierzchni. To z kolei może wpływać na formę LPS-u obecną w środowisku i siłę wywołanej odpowiedzi zapalnej. Naturalną odpowiedź immunologiczną zbadano w kilku liniach komórkowych A549, HeLa, THP1-Xblue2 i THP1-Null2 przy użyciu różnych typów LPS-ów pochodzących z P. aeruginosa oraz E. coli. Jednak po wynikach uzyskanych z mikromacierzy do dalszych badań wybrano monocytarne linie komórkowe. Analizy wykazały, że geny, które charakteryzowała nadekspresja w komórkach THP1-Xblue były powiązane z odpowiedzią immunologiczną na lipopolisacharyd, ale bez zmiany w ekspresji gazderminy D. Aby zweryfikować, czy LPS może aktywować pyroptozę, zidentyfikowao obecność białek GSDMD i IL-1β. Oba wyniki wyraźnie wskazały, że bakteryjny LPS może aktywować proces pyroptozy i indukować cięcie GSDMD w obecności nigerycyny. Indukcja pyroptozy przez LPS P. aeruginosa jest znacznie słabsza w porównaniu do LPS-u E. coli.},
 abstract={Nie zaobserwowano natomiast działania przeciwbakteryjnego medium pohodowlanego komórek THP1-Null2 stymulowanych tymi LPS-ami i nigerycyną z endolizyną na szczepy P. aeruginosa PAO1 i ΔwbpL. Zbadano również bezpośrednią przepuszczalność zewnętrznej błony bakteryjnej dwóch szczepów P. aeruginosa PAO1 i ΔwbpL przy użyciu rekombinowanego białka gazderminy D i jego N-końca (uzyskany po inkubacji z kaspazą-4) w połączeniu z endolizyną faga. Na podstawie wyników stwierdzono, że LPS-y odgrywają kluczową rolę w interakcji między białkami a błoną bakteryjną. Badanie ekspresji białka gazderminy D w medium pohodowlanym komórek liniach THP1-Null2 stymulowanych LPS-ami wobec P. aeruginosa PAO1, wykazało indukcję procesu w próbach kontrolnych. Efekt ten może świadczyć o nieindukowanym, bazowym poziomie produkcji gazderminy która jako modulująca odpowiedź immunologiczną, warunkuje jej skuteczność. Podsumowując tą część badań, gazdermina GSDMD umożliwia permeabilizację błony komórkowej, co wzmacnia aktywność bójczą endolizyny co wykazano w badanich z użyciem rekombinowanych białek. Jednak indukcja gazderminy na drodze pyroptozy nie wzmacnia efektu endolizyny, co może być związane z regulacją procesu pyroptozy. Zbyt silna indukcja białek permeabilizujących w trakcie odpowiedzi immunologicznej na drodze pyroptozy w obecności LPS-u może być zjawiskiem cytotoksycznym dla komórek. Ich bezpieczny poziom jest jednak zbyt niski do wspomagania efektu bójczego endolizyny wobec komórek bakteryjnych.},
 abstract={The increase of an antibiotic resistance leads to the search for alternative strategies of eliminate Gram-negative bacteria. An important problem in the delivery of drugs with clinical potential is their ability to cross the outer bacterial membrane. The aim of the research was the search for new alternative methods of permeabilization of the outer cell membrane of Gram-negative bacteria, which could additionally support the bactericidal effect of recombinant phage endolysin K27. The posibility incerase permability of outer membrane was examinated by used cationic maltose-modified dendrimers, dendritic gold nanoparticles and by activation of the natural prosess such as a pyroptosis. Pyroptosis is an immune response of eukaryotic cells to bacterial cell components, mainly lipopolysaccharide, leading to the secretion of gasdermin D protein, which may result in permabilization of the bacterial cell membrane. Polycationic compounds have been shown to destabilize the outer bacterial membrane of P. aerugonosa, aiding the transport of endolysin to the peptidoglycan. It has been observed that not only bacterial lipopolysaccharide is the main obstacle for highly charged cationic dendrimers to destabilize the membrane and reach endolysin, but also surface modifications of dendrimers. Reducing the positive charge and concentration in polypropylene-imine maltose dendrimers significantly increased the antibacterial effect of endolysin. At the same time, modification of the surface of dendrimers leads to the inhibition of endolysin activity at a lower temperature (<30oC) compared to unmodified dendrimers. In further studies, gold nanoparticles were used to test whether they could induce the pyroptosis process. For this purpose, the THP-1 cell line was used. Dendritic AuNPs induced caspase-1 activity and increased IL-18 and IL-1β release without inducing gazdermin D cleavage and pore formation. The production of pro-inflammatory cytokines was evident mainly in the presence of bacterial LPS, although their secretion was observed only after administration of dendritic AuNPs. These observations suggest that dendritic AuNPs can induce pyoptosis-like inflammatory mechanisms further enhanced in the presence of bacterial LPS. The intensity of this effect depended on the AuNP surface modification. These results clearly suggest that the nature of the interaction between NPs and LPSs depends on the generation of dendrons and the number of PEG chains attached to their surfaces. This, in turn, may influence the form of LPS present in the environment and the strength of the inflammatory response elicited. The natural immune response was tested in several cell lines A549, HeLa, THP1-Xblue2 and THP1-Null2 using different types of LPS derived from P. aeruginosa and E. coli. However, after the results obtained from the microarray, monocytic cell lines were selected for further research. Analyzes showed that genes that were overexpressed in THP1-Xblue cells were associated with an immune response to lipopolysaccharide, but no change in gasdermin D expression.},
 abstract={To verify whether LPS could activate pyroptosis, the presence of GSDMD and IL-1β proteins was identified. Both results clearly indicated that bacterial LPS can activate the pyroptosis process and induce GSDMD cleavage in the presence of nigericin. The induction of pyroptosis by P. aeruginosa LPS is much weaker compared to E. coli LPS. However, the antibacterial effect of the post-culture medium of THP1-Null2 cells stimulated with these LPSs and nigericin with endolysin on P. aeruginosa PAO1 and ΔwbpL strains was not observed. The direct permeability of the bacterial outer membrane of two strains of P. aeruginosa PAO1 and ΔwbpL was also tested using recombinant gasdermin D protein and its N-terminus (obtained after incubation with caspase-4) in combination with phage endolysin. Based on the results, it was concluded that LPS plays a key role in the interaction between proteins and the bacterial membrane. The study of gasdermin D protein expression in the post-culture medium of LPS-stimulated THP1-Null2 cells against P. aeruginosa PAO1 showed induction of the process in control samples. This effect may indicate a non-induced, base level of gasdermin production, which modulates the immune response and determines its effectiveness. To sum up this part of the research, gasdermin GSDMD will enable the permeabilization of the cell membrane, which enhances the killing activity of endolysin what has been shown in studies using recombinant proteins. However, the induction of gasdermin by pyroptosis does not enhance the effect of endolysin, which may be related to the regulation of the pyroptosis process. Too strong induction of permeabilizing proteins during the immune response by pyroptosis in the presence of LPS may be a cytotoxic phenomenon for cells. Their low, safe level, however, is too low to support the killing effects of endolysin against bacterial cells.},
 title={Metody permeabilizacji błony komórkowej bakterii gram-ujemnych wspomagające działanie bójcze rekombinowanej endolizyny fagowej},
 type={rozprawa doktorska},
}