@misc{Skrzyniarz_Kinga_Katarzyna_Biofizyczna,
 author={Skrzyniarz, Kinga Katarzyna},
 howpublished={online},
 school={Uniwersytet Jana Kochanowskiego w Kielcach},
 language={pol},
 abstract={Antibiotic resistance is an ever-growing threat to public health due to the overuse and misuse of antibiotics, including in outpatient clinics, hospitals, veterinary medicine, agriculture and many other areas of life. The World Health Organization (WHO) estimates that microbial resistance to antibiotics contributes to 1.27 million deaths worldwide each year, including 4.95 million deaths as an indirect cause. In 2019, Poland recorded 5,600 deaths directly related to antibiotic resistance and 24,100 deaths indirectly related to this phenomenon in the same year. The number of deaths due to antibiotic resistance in the world may increase to up to 10 million annually by 2050. Between 2000 and 2020, global antibiotic use increased by 65% and continues to rise. The latest WHO report only mentions 27 new antibiotics that are currently at the clinical trial stage. Of this number, only a few seem to be innovative enough to deal with the most resistant bacteria. For comparison, at the same time, over a thousand oncology drugs are in this phase of research. In the years 2017-2021, only one new antibiotic was registered, capable of defeating superbugs from the WHO list. Specialists in this field have identified the most dangerous bacteria called ESKAPE bacteria. The name is an acronym defining a group of drug-resistant bacteria, which includes: Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa and Enterobacter spp. These are pathogens capable of escaping the action of available antibiotics, representing a new paradigm in the field of pathogenesis, transmission and resistance. When considering the problem of antibiotic resistance in order to design new effective methods to combat this problem, we should primarily focus on the outer bacterial membrane (OM) of Gram-negative bacteria. This membrane is a serious complication because it is an extremely problematic barrier that prevents most available antibiotics from penetrating into the bacteria. For this reason, all types of nanomaterials and antibacterial proteins are extremely attractive substances. Therefore, newly designed agents should focus primarily on the bacterial outer membrane (OM), i.e. agents that permeabilize the membrane and change its fluidity. Another extremely important aspect when designing new means is the lipid composition of individual bacterial membranes of various groups of bacteria. The composition of membranes affects the surface (membrane) charge and therefore may contribute to differences in the mechanism of action of the materials used. The aim of the research of this doctoral thesis was a biophysical analysis of the mechanism of permeabilization of the outer bacterial membrane with the participation of dendritic nanoparticles, taking into account the lipid composition of the outer membrane of the bacterial models used. Knowledge of the mechanism associated with bacterial membrane permeabilization may contribute to the development of new alternative methods effective in the fight against resistant strains in the future. At the beginning, two types of dendronized carbosilane silver nanoparticles were analyzed: dendronized silver nanoparticles (Dend-AgNPs) and pegylated dendronized silver nanoparticles (PEG-Dend-AgNPs), as systems alone and in the presence of lysozyme. First, the antibacterial activity of both nanoparticles and their systems with lysozyme was checked. The activity of dendronized silver nanoparticles and lysozyme was measured on an exponentially growing culture of P. aeruginosa. The obtained results show a similar antibacterial effect when both types of nanoparticles are used. When lysozyme is included in the system, the antibacterial effect becomes much better.},
 abstract={In order to investigate the mechanism of action of nanoparticles, an experiment was carried out examining the process of permeabilization of the bacterial outer membrane (OM). The obtained data present two different mechanisms of action. In the case of Dend-AgNPs, the permeabilization effect is much stronger, these nanoparticles damage the OM, allowing lysozyme to penetrate inside the bacteria. PEG-Dend-AgNPs, on the other hand, aggregate on the surface of bacteria, the permeabilization effect is weaker, nanoparticles cause aggregation of bacteria, inhibiting their growth. Additionally, the killing effect is supported by the generation of reactive oxygen species (Skrzyniarz et al, International Journal of Biological Macromolecules 2023). Then, the type of interactions of the tested dendritic nanoparticles with the bacterial membrane was checked on a liposomal model (liposomal model of the outer bacterial membrane of the bacterial strain P. aeruginosa). In the case of Dend-AgNPs, the results showed a static type of interaction between the membrane and the nanoparticle, forming a stable complex. An exothermic type of reaction and spontaneity at low temperatures were demonstrated. Completely different results were obtained in the case of PEG-Dend-AgNPs. The interaction between the nanoparticle and the membrane is dynamic, creating a less stable complex. An endothermic and spontaneous reaction was demonstrated only at high temperatures. Bacterial morphology and bacterial peptidoglycan degradation of strains treated with nanoparticles were checked by transmission electron microscopy (TEM) and fluorescence microscopy using the fluorescent marker HADA (FDAA 7-hydroxycoumarincarbonylamino- D-alanine). Photos taken using a TEM microscope showed black points, i.e. dendritic silver nanoparticles, accumulating on the bacterial surface. In the case of Dend-AgNPs, a disruption of the bacterial cell membrane and the release of internal substances is visible. When it comes to PEG-Dend-AgNPs, you can see bacterial cells aggregating. Fluorescence microscopy photos show that Dend-AgNPs damage bacterial peptidoglycan, and when using lysozyme, the effect is even stronger and partial degradation of peptidoglycan occurs. However, in photos with PEGDend- AgNPs this effect is much weaker. The second work included in the doctoral dissertation was research on the permebilization of the bacterial membrane by two types of cationic carbosilane imidazole dendrimers: D1 (BDTRP 001) C98H200N16Si138+ and D2 (BDSTM 001) C160H268C18N24Si13. The influence of the lipid composition of bacterial membranes on the level of membrane destabilization was also investigated. For this purpose, liposomal models of three types of bacteria were made: P.aeruginosa, E.coli and A.baumanii (Skrzyniarz et al, Journal of Colloid and Interface Science, 2024). First, the physicochemical properties of the prepared liposomes and dendrimers were examined in order to examine their size and electrokinetic potential. Dynamic light scattering (DLS) and Zeta potential experiments were performed. In order to investigate the properties of various liposomal models (and thus investigate differences in the reaction mechanism depending on the liposomal composition) depending on the dendrimer used, an experiment was performed to investigate changes in membrane fluidity. For this purpose, two membrane markers were used: TMA-DPH (integrated into the hydrophilic layer) and DPH (incorporated into the hydrophilic layer). The experiment was performed to check which layer of the outer membrane and how the dendrimers used in the experiment affect it. The results obtained are different for both dendrimers used. Only in the case of D1 were changes in the fluidity of the outer lipid layer observed.},
 abstract={The next step was to carry out fluorescence quenching tests using the Cyanine 5 (Cy5) marker, which was used to label one of the lipids used to build liposomes (DOPE). Thermodynamic analysis showed that a high concentration of lipids, i.e. CL (cardiolipin) and DOPE (1,2- dioleoyl-sn-glycero-3-PE) in the membrane content of a given bacterium guarantees greater affinity of antibacterial dendrimers and causes greater permeabilization of the bacterial membrane and an increase in its permeability. TEM microscopy was used to examine the effects of dendrimers on each liposomal model. The obtained photos presenting models treated with dendrimer D1 show damaged or disintegrating liposomes and their fragments, while in the case of D2, spherical, undamaged shapes of liposomes can be observed. The last stage of the work was in vitro testing. The aim of this experiment was to check whether membrane destabilization can cause endolysin to penetrate the outer bacterial membrane, degrade the peptidoglycan and consequently increase the killing effect. An exponentially growing culture of P. aeruginosa bacteria and endolysin were used for this analysis. In relation to the first dendrimer (D1), an antibacterial effect occurs. The outer membrane is damaged. The addition of endolysin does not increase the killing effect. The second dendrimer (D2) itself does not destroy the outer bacterial membrane, but significantly affects its fluidity. In this way, it allows endolysin to penetrate the interior of the bacteria. The aim of the presented work was a biophysical analysis of the mechanism of permeabilization of the outer bacterial membrane using dendritic nanoparticles. The research confirmed the significant role of dendronized nanoparticles and antibacterial proteins as future agents in the fight against antibiotic-resistant bacterial strains. These substances have many positive features, such as the great ability to modify the surface of dendrimers, the possibility of permeabilization and the impact on the fluidity of biological membranes, as well as many others. However, when designing new agents, a very important aspect should be taken into account, which is the lipid composition of the outer bacterial membrane of individual bacterial strains. In the above dissertation, it was proven that the composition of membranes influences the type of interaction of various dendritic nanoparticles with the outer bacterial membrane. Understanding the mechanism accompanying the integration between the bacterial membrane and the nanomaterials is crucial in the development of new therapeutic agents, which in the future may prove crucial in the fight against the constantly growing problem of drug resistance.},
 abstract={Antybiotykooporność jest stale rosnącym zagrożeniem dla zdrowia publicznego w związku z nadużywaniem i niewłaściwym stosowaniem antybiotyków, między innymi w ambulatoriach, szpitalach, weterynarii, rolnictwie i wielu innych dziedzinach życia. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) szacuje, że oporność mikroorganizmów na antybiotyki przyczynia się rocznie do 1,27 mln zgonów na świecie, w tym 4,95 mln zgonów, jako przyczyna pośrednia. W roku 2019 w Polsce odnotowano 5 600 zgonów bezpośrednio związanych z opornością na antybiotyki i 24 100 zgonów pośrednio związanych z tym zjawiskiem w tym samym roku. Liczba zgonów z powodu antybiotykooporności na świecie do roku 2050 może wzrosnąć nawet do 10 milionów rocznie. W latach 2000–2020 globalne stosowanie antybiotyków wzrosło o 65% i w dalszym ciągu rośnie. Najnowszy raport WHO wspomina jedynie o 27 nowych antybiotykach, które aktualnie są na etapie badań klinicznych. Z tej liczby zaledwie kilka wydaje się być na tyle innowacyjne, aby móc poradzić sobie z najbardziej opornymi bakteriami. Dla porównania – w tym samym czasie w tej fazie badań znajduje się ponad tysiąc leków onkologicznych. W latach 2017-2021 zarejestrowano tylko jeden nowy antybiotyk, zdolny do pokonania superbakterii z listy WHO. Specjaliści w tej dziedzinie wyodrębnili najniebezpieczniejsze bakterie określone mianem bakterii z grupy ESKAPE. Nazwą jest akronim określający grupę lekoopornych bakterii, do której zalicza się: Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa i Enterobacter spp. Są to patogeny zdolne do ucieczki przed działaniem dostępnych antybiotyków, reprezentujące nowy paradygmat w zakresie patogenezy, transmisji i oporności. Rozważając problem antybiotykoodporności w celu projektowania nowych skutecznych metod do walki z tym problemem należy przede wszystkim skupić się na zewnętrznej błonie bakteryjnej (OM) bakterii Gram ujemnych. Błona ta stanowi poważną komplikację, gdyż jest niezwykle problematyczną barierą uniemożliwiającą wnikanie do wnętrza bakterii większości dostępnych antybiotyków. Z tego względu niezwykle atrakcyjnymi substancjami są wszelkiego typu nanomateriały oraz peptydy przeciwbakteryjne. Dlatego też nowo projektowane środki powinny skupiać się przede wszystkim na zewnętrznej błonie bakteryjnej (OM), czyli środkach permeabilizujących błonę oraz zmieniających jej płynność. Kolejnym niezmiernie ważnym aspektem podczas projektowania nowych środków przeciwdrobnoustrojowych jest skład lipidowy poszczególnych błon bakteryjnych różnych grup bakterii. Skład błon wpływa na ładunek powierzchniowy (błonowy) a więc może przyczyniać się do różnić w mechanizmie działania zastosowanych materiałów. Celem badań niniejszej pracy doktorskiej była biofizyczna analiza mechanizmu permeabilizacji zewnętrznej błony bakteryjnej przy udziale dendrytycznych nanocząstek z uwzględnieniem składu lipidowego zewnętrznej błony wykorzystanych modeli bakteryjnych. Znajomość mechanizmu towarzyszącemu permeabilizacji błony bakteryjnej może w przyszłości przyczynić się do rozwoju nowych alternatywnych metod skutecznych w walce z opornymi szczepami. Na wstępie, analizie poddano dwa rodzaje dendronizowanych karbosilanowych nanocząstek srebra: dendronizowane nanocząstki srebra (Dend-AgNPs) oraz pegylowane dendronizowane nanocząstki srebra (PEG-Dend-AgNPs), jako samych układów oraz w obecności lizozymu. W pierwszej kolejności sprawdzono aktywność antybakteryjną obu nanocząstek oraz ich układów z lizozymem. Aktywność dendronizowanych nanocząstek srebra oraz lizozymu mierzono na wykładniczo rosnącej kulturze P. aeruginosa. Uzyskane wyniki ukazują podobny efekt przeciwbakteryjny w przypadku zastosowania obu rodzajów nanocząstek. W sytuacji uwzględnienia lizozymu w układzie efekt przeciwbakteryjny staje się zdecydowanie lepszy (Skrzyniarz i inni, International Journal of Biological Macromolecules 2023).},
 abstract={W celu zbadania mechanizmu działania nanocząstek przeprowadzono eksperyment badający proces permeabilizacji zewnętrznej błony bakteryjnej (OM). Uzyskane dane prezentują dwa odmienne mechanizmy działania. W przypadku Dend-AgNPs efekt permeabilizacji jest zdecydowanie silniejszy, nanocząstki te uszkadzają OM umożliwiając wnikanie lizozymu do wewnątrz bakterii. PEG-Dend-AgNPs natomiast agregują na powierzchni bakterii, efekt permeabilizacji jest słabszy, nanocząstki powodują agregację bakterii hamując ich rozwój. Dodatkowo efekt bójczy jest wspomagany generowaniem reaktywnych form tlenu (Skrzyniarz in inni, International Journal of Biological Macromolecules 2023). Następnie sprawdzono rodzaj oddziaływań testowanych dendrytycznych nanocząstek z błoną bakteryjną na modelu liposomalnym (liposomalny model zewnętrznej błony bakteryjnej szczepu bakteryjnego P. aeruginosa).W przypadku Dend-AgNPs wyniki wykazały statyczny rodzaj interakcji między błoną a nanocząstką, tworzącą stabilny kompleks. Wykazano egzotermiczny rodzaj reakcji oraz spontaniczność przy niskich temperaturach. Zupełnie odmienne wyniki otrzymano w przypadku PEG-Dend-AgNPs. Interakcja między nanocząstką a błoną jest dynamiczna, tworząc mniej stabilny kompleks. Wykazano rodzaj reakcji endotermicznej oraz spontanicznej tylko w wysokich temperaturach. Morfologia bakterii oraz degradacja peptydoglikanu bakteryjnego szczepów traktowanych nanocząstkami sprawdzono za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) oraz mikroskopii fluorescencyjnej z wykorzystaniem znacznika fluorescecyjnego HADA (FDAA 7- hydroksykumarynokarbonyloamino-D-alanina). Zdjęcia wykonane za pomocą mikroskopu TEM ukazały akumulujące się na powierzchni bakterii czarne punkty, czyli dendrytyczne nanocząstki srebra. W przypadku Dend-AgNPs widać przerwanie błony komórkowej bakterii i wypływ substancji wewnętrznych. Jeśli chodzi o PEG-Dend-AgNPs można zobaczyć agregujące komórki bakteryjne. Na zdjęciach z mikroskopii fluorescencyjnej można zauważyć, iż Dend-AgNPs uszkadzają bakteryjny peptydoglikan, a przy użyciu lizozymu efekt jest jeszcze silniejszy i następuje częściowa degradacja peptydoglikanu. Natomiast na zdjęciach z PEGDend- AgNPs ten efekt jest znacznie słabszy. Drugą pracą wchodzącą w skład rozprawy doktorskiej były badania nad permabilizacją błony bakteryjnej przez dwa rodzaje kationowych karbosilanowych dendrymerów imidazolowych: D1 (BDTRP 001) C98H200N16Si138+ oraz D2 (BDSTM 001) C160H268C18N24Si13. Badano również wpływ składu lipidowego błon bakteryjnych na poziom destabilizacji błony. W tym celu wykonano modele liposomalne trzech rodzajów bakterii: P.aeruginosa, E.coli oraz A.baumanii (Skrzyniarz i inni, Journal of Colloid and Interface Science, 2024). Na wstępie przeprowadzono badania właściwości fizykochemicznych przygotowanych liposomów oraz dendrymerów, w celu zbadania ich wielkości oraz potencjału elektrokinetycznego. Wykonano eksperymenty dynamicznego rozpraszania światła (DLS) oraz potencjału Zeta. Chcąc zbadać właściwości różnych modeli liposomalnych (a więc zbadać różnice w mechanizmie reakcji zależne od składu liposomalnego) w zależności do użytego dendrymeru, wykonano eksperyment badając zmiany w płynności błony. W tym celuwykorzystano dwa znaczniki błonowe: TMA-DPH (wbudowujący się w warstwę hydrofilową) oraz DPH (wbudowujący się w warstwę hydrofilową). Doświadczenie wykonano w celu sprawdzenia, na którą warstwę zewnętrznej bony i w jaki sposób użyte w doświadczeniu dendrymery oddziałują. Uzyskane wyniki są różne w przypadku obu zastosowanych dendrymerów. Tylko w przypadku D1 zaobserwowano zmiany w płynności zewnętrznej warstwy lipidowej.},
 abstract={Następnym krokiem było przeprowadzenie badań wygaszania fluorescencji, z wykorzystaniem znacznika Cyjaniny 5 (Cy5), którym został wyznakowany jeden z lipidów wykorzystanych do budowy liposomów (DOPE). Analiza termodynamiczna wykazała, iż wysokie stężenie lipidów tj. CL (kardiolipina) oraz DOPE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-PE) w zawartości błony danej bakterii gwarantuje większe powinowactwo dendrymerów antybakteryjnych i powoduje większą permeabilizację błony bakteryjnej oraz zwiększenie jej przepuszczalności. W celu zbadania efektów działania dendrymerów na każdy z modeli liposomalnych, wykorzystano mikroskopię TEM. Uzyskane zdjęcia prezentujące modele traktowane dendrymerem D1 ukazują uszkodzone bądź rozpadające się liposomy oraz ich fragmenty, natomiast w przypadku D2 można zaobserwować kuliste nieuszkodzone kształty liposomów. Ostatnim etapem pracy były testy in vitro Celem tego eksperymentu było sprawdzenie, czy destabilizacja błony może spowodować przedostawanie się endolizyny przez zewnętrzną błonę bakteryjną, degradację peptydoglikanu i w konsekwencji zwiększenie efektu bójczego, Do tej analizy wykorzystano wykładniczo rosnącą hodowlę bakterii P.aeruginosa oraz endolizynę. W odniesieniu do dendrymeru pierwszego (D1) występuje efekt antybakteryjny. Zewnętrzna błona zostaje uszkodzona. Dodatek endolizyny nie zwiększa efektu bójczego. Dendrymer drugi (D2) sam w sobie nie niszczy zewnętrznej błony bakteryjnej, ale znacząco wpływa na jej płynność. Umożliwia w ten sposób endolizynie wniknięcie do wnętrza bakterii. Podsumowując, celem przedstawionych prac była biofizyczna analiza mechanizmu permeabilizacji zewnętrznej błony bakteryjnej przy udziale dendrytycznych nanocząstek. Badania potwierdziły znaczącą rolę dendronizowanych nanocząstek oraz białek antybakteryjnych, jako przyszłościowych środków w walce z antybiotykoopornymi szczepami bakteryjnymi. Za tymi substancjami przemawia wiele pozytywnych cech takich jak ogromna możliwość modyfikowania powierzchni dendrymerów, możliwość permeabilizowania oraz wpływ na płynność błon biologicznych jak i wiele innych. Jednak projektując nowe środki należy uwzględnić bardzo ważny aspekt, jakim jest skład lipidowy zewnętrznej błony bakteryjnej poszczególnych szczepów bakteryjnych. W powyższej rozprawie udowodniono, że skład błon ma wpływ na rodzaj interakcji różnych dendrytycznych nanocząstek z zewnętrzną błoną bakteryjną. Poznanie mechanizmu towarzyszącemu integracji między błoną bakteryjną a nanomateriałami jest kluczowe w kwestii opracowywania nowych środków terapeutycznych, które w przyszłości mogą okazać się kluczowe w walce ze stale rosnącym problemem lekooporności.},
 title={Biofizyczna analiza mechanizmu permeabilizacji zewnętrznej błony bakteryjnej przy udziale dendrytycznych nanocząstek},
 type={rozprawa doktorska},
}